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大鼠血小板衍生生長因子(PDGF)ELISA試劑盒使用說明書
BS-2952大鼠血小板衍生生長因子(PDGF)ELISA試劑盒 天津本生
一、試劑盒原理
大鼠血小板衍生生長因子(PDGF)ELISA試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)進行檢測。該方法基于特異性抗體與PDGF分子的結(jié)合反應(yīng),通過酶催化底物顯色來定量測定樣本中PDGF的含量?。
實驗原理具體為:將抗大鼠PDGF單克隆抗體預(yù)先包被在酶標(biāo)板上,加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣本后,其中的PDGF會與固相抗體結(jié)合。隨后加入生物素化的檢測抗體,形成"抗體-抗原-抗體"復(fù)合物。再加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鏈霉親和素與生物素結(jié)合,最后加入底物TMB顯色。在HRP催化下,TMB顯藍(lán)色,加入終止液后變?yōu)辄S色,顏色的深淺與樣本中PDGF濃度成正比,通過測定450nm處的吸光度(OD值)即可計算出PDGF含量?。
二、試劑盒組成
本試劑盒通常包含以下主要組分(具體組成可能因不同廠家有所差異):
預(yù)包被酶標(biāo)板?:96孔或48孔,已包被抗PDGF抗體?
PDGF標(biāo)準(zhǔn)品?:凍干粉或溶液形式,濃度通常為2000-2700ng/L,使用前需用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液重建?
樣品稀釋液?:用于稀釋樣本和標(biāo)準(zhǔn)品?
生物素化檢測抗體?:特異性識別PDGF的抗體?
酶結(jié)合物?:HRP標(biāo)記的鏈霉親和素?
TMB底物溶液?:包含A液和B液,顯色用?
終止液?:通常為硫酸溶液,用于終止反應(yīng)?
濃縮洗滌液?:20×或25×濃縮,使用前需稀釋?
封板膜?:防止蒸發(fā)和污染?
三、樣本收集與處理
1. 樣本類型
本試劑盒適用于檢測大鼠血清、血漿(EDTA、肝素或檸檬酸鹽抗凝)、細(xì)胞培養(yǎng)上清液和組織勻漿等樣本中的PDGF含量?。
2. 樣本收集
血清?:全血室溫放置2小時或4℃過夜后,1000×g離心20分鐘取上清?
血漿?:使用抗凝管采集后30分鐘內(nèi),1000×g離心15分鐘?
細(xì)胞上清?:1000×g離心10分鐘去除顆粒?
組織勻漿?:加入適量生理鹽水勻漿后,1000×g離心10分鐘取上清?
3. 樣本保存
樣本在2-8℃可保存48小時,如需長期保存應(yīng)分裝后于-20℃或-80℃凍存,避免反復(fù)凍融?。檢測前血清樣本通常需用稀釋液作1:5至10倍稀釋?。
四、實驗操作步驟
1. 試劑準(zhǔn)備
標(biāo)準(zhǔn)品配制?:將凍干標(biāo)準(zhǔn)品用1ml蒸餾水或標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液重建,按說明書進行系列稀釋(通常設(shè)7-8個濃度梯度)?
洗滌液配制?:將濃縮洗滌液用蒸餾水按1:20稀釋(如1ml濃縮液加19ml水)?
抗體工作液配制?:按說明書比例用檢測稀釋液稀釋生物素化抗體和酶結(jié)合物?
2. 檢測程序
加樣?:每孔加入100μl標(biāo)準(zhǔn)品或處理好的樣本,設(shè)置空白對照孔?
孵育?:37℃溫育30-120分鐘(具體時間依試劑盒說明)?
洗滌?:棄去孔內(nèi)液體,每孔加滿洗滌液靜置1分鐘后棄去,重復(fù)4-6次,最后在吸水紙上拍干?
加檢測抗體?:每孔加入100μl生物素化抗體工作液,37℃孵育60分鐘?
洗滌?:同步驟3?
加酶結(jié)合物?:每孔加入100μl HRP標(biāo)記的鏈霉親和素,37℃孵育30分鐘?
洗滌?:同步驟3?
顯色?:每孔加入100μl TMB底物,37℃避光反應(yīng)15分鐘?
終止?:每孔加入100μl終止液,輕輕混勻?
讀數(shù)?:30分鐘內(nèi)在酶標(biāo)儀450nm處測定OD值(建議使用630nm作為參考波長)?
五、結(jié)果計算
空白校正?:所有OD值應(yīng)減去空白對照孔的OD值?
繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?:以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)(對數(shù)坐標(biāo)),相應(yīng)OD值為縱坐標(biāo)(線性坐標(biāo)),在坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?
濃度計算?:
根據(jù)樣品OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出對應(yīng)的PDGF濃度?
若樣本經(jīng)過稀釋,需乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)?
也可通過回歸方程計算濃度:使用標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和OD值計算直線回歸方程,將樣本OD值代入方程求出濃度?
六、注意事項
試劑保存?:未使用的試劑應(yīng)嚴(yán)格按說明書要求保存(通常2-8℃),避免反復(fù)凍融?
溫度平衡?:所有試劑和樣本使用前應(yīng)室溫平衡30分鐘?
操作規(guī)范?:
不同批號試劑不可混用?
加樣時避免觸碰孔壁和產(chǎn)生氣泡?
嚴(yán)格控制各步驟的孵育時間和溫度?
洗滌要充分,防止交叉污染?
樣本處理?:
避免使用溶血、高血脂或反復(fù)凍融的樣本?
組織樣本應(yīng)充分勻漿?
安全防護?:
TMB底物有毒性,終止液有腐蝕性,應(yīng)避免接觸皮膚?
實驗廢棄物應(yīng)按規(guī)定處理?
七、性能參數(shù)
靈敏度?:最小檢測濃度通常小于15pg/ml?
檢測范圍?:常見為15.625-1000pg/ml或31.2-2000pg/ml?
注:以上資料僅供參考,不作為具體依據(jù),如果完整產(chǎn)品說明請咨詢技術(shù)老師或品牌供應(yīng)商。
天津本生一直視質(zhì)量控制為企業(yè)的生命,追求企業(yè)競爭力的不斷提升。公司在經(jīng)營中始終秉承:遵紀(jì)守法,嚴(yán)于律己,寬仁以待,敢于承擔(dān)的企業(yè)精神作為標(biāo)準(zhǔn),以過硬的質(zhì)量和優(yōu)良的服務(wù)來維護和拓展市場,較大限度的滿足客戶的需求。與客戶的共贏,是我們的發(fā)展目標(biāo)。本生!您信任的合作伙伴。我們愿與您真誠合作,共創(chuàng)美好的未來。
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