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人腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA檢測試劑盒實驗使用說明書
BS-0121人腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA試劑盒
一、試劑盒簡介
本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附法(ELISA)技術，專用于定量檢測人血清、血漿或細胞培養上清液中腫瘤壞死因子α(TNF-α)的濃度。TNF-α是一種關鍵的細胞因子，在炎癥反應、免疫調節及細胞凋亡中發揮重要作用。本試劑盒僅供科研使用，不可用于臨床診斷。
二、試劑盒組成
預包被抗體酶標板?：96孔板，包被有抗人TNF-α單克隆抗體，用于捕獲樣本中的TNF-α。
凍干標準品?：2支，用于繪制標準曲線，濃度范圍覆蓋檢測需求。
生物素標記檢測抗體?：與TNF-α特異性結合，形成免疫復合物。
辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素(HRP-Streptavidin)?：與生物素標記抗體結合，催化顯色反應。
顯色底物(TMB)?：在HRP催化下產生藍色產物，酸終止后變黃。
終止液(2M溶液)?：終止顯色反應，穩定顏色。
濃縮洗滌液(20倍)?：用于洗滌酶標板，去除未結合物質。
樣本稀釋液?：稀釋樣本至適宜濃度。
封板膜?：防止蒸發和污染。
注：所有試劑需2-8℃避光保存，有效期6個月。
三、實驗前準備
試劑平衡?：所有試劑及樣本使用前需室溫(18-25℃)平衡30分鐘，避免直接加熱。
標準品配制?：
每支凍干標準品加1mL標準品稀釋液，室溫靜置10分鐘，輕柔混勻。
配制梯度：從原液(如2000pg/mL)開始，進行系列稀釋(如1000→500→250→125→62.5→31.2→0pg/mL)，共7個濃度點，空白孔為0pg/mL。
洗滌液配制?：20mL濃縮洗滌液加580mL蒸餾水，混勻備用。
檢測抗體工作液?：臨用前將生物素標記抗體用檢測稀釋液按1:100稀釋(如10μL抗體+990μL稀釋液)。
酶結合物工作液?：HRP標記鏈霉親和素按1:100稀釋。
四、樣本處理
血清/血漿?：避免溶血，4℃保存不超過3天，-20℃長期保存避免反復凍融。檢測前離心去除顆粒物。
細胞培養上清?：離心去除細胞碎片，檢測前確認細胞狀態。若樣本濃度過高，建議預實驗確定稀釋倍數。
五、操作步驟
加樣?：每孔加入100μL標準品或樣本，37℃孵育90分鐘。
洗滌?：棄去孔內液體，每孔加400μL洗滌液，靜置1-2分鐘后甩干，重復3次。
加檢測抗體?：每孔加100μL生物素化抗體工作液，37℃孵育60分鐘。
洗滌?：同步驟2，重復3次。
加酶結合物?：每孔加100μL酶結合物工作液，37℃孵育30分鐘。
洗滌?：同步驟2，重復5次。
顯色?：每孔加90μL TMB底物，37℃避光孵育15分鐘。
終止反應?：每孔加50μL終止液，立即測定OD值(450nm波長)。
六、注意事項
標準曲線異常處理?：
平直曲線：檢查標準品溶解是否充分、洗板是否凈、移液是否準確。
高值樣本：建議稀釋后復測。
樣本處理?：
避免使用含NaN3的樣本，因NaN3抑制HRP活性。
細胞上清需離心后檢測，避免細胞碎片干擾。
關鍵控制點?：
每步孵育時間誤差不超過±5分鐘。
洗板時拍板力度適中，避免交叉污染。
顯色時間嚴格控制，避免過度反應。
七、結果計算
以標準品濃度(pg/mL)為橫坐標，OD450值為縱坐標繪制標準曲線。
樣本OD值代入標準曲線方程計算濃度，若超出檢測范圍(如31.2-2000pg/mL)需稀釋后重測。
靈敏度：最小檢測濃度小于15pg/mL，板內/板間變異系數<10%。
八、常見問題解答
問題現象 可能原因 解決方案
顯色過快 酶結合物過量 減少孵育時間或稀釋酶結合物
背景過高 洗滌不凈 增加洗滌次數至5次
重復性差 移液誤差 校準移液器，使用多道加樣器
九、儲存條件
未開封試劑盒：2-8℃避光保存。
已配制試劑：標準品溶液建議現配現用，其他工作液4℃保存不超過7天。
注：以上僅供參考，本產品僅供科研使用，不作為實際數據，實驗需嚴格遵循說明或咨詢技術老師。
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